Bioschmierstoffe Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V.

 

Projekte - Details

Entwicklung einer Nachweismethode zur Bewertung von Saatgutchargen bezüglich des prozentualen Befalls von Fenchelfrüchten und Jungpflanzen mit Mycosphaerella anethi

Anschrift
Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen (JKI) - Institut für Epidemiologie und Pathogendiagnostik
48161 Münster
Toppheideweg 88
Kontakt
Prof. Dr. rer. nat. Thomas Kühne
Tel: +49 3946 47-501
E-Mail: thomas.kuehne@julius-kuehn.de
FKZ
22018208
Anfang
01.12.2008
Ende
31.05.2012
Aufgabenbeschreibung
Mycosphaerella anethi verursacht im deutschen Arzneifenchelanbau regelmäßig Ertragsverluste bis zu 80 %. Ohne effektive Bekämpfungsstrategie ist die wirtschaftliche Produktion nicht mehr möglich. Unlängst konnten wir nachweisen, dass der Erreger hochgradig samenübertragbar ist. Möglicherweise ist das gesamte Saatgut bereits pilzbelastet. Zur Aufklärung dieses Sachverhaltes soll eine PCR-Methode zum sicheren und empfindlichen Nachweis von M. anethi in Früchten und Jungpflanzen entwickelt werden. Mittels Real-Time PCR soll nachfolgend die Quantifizierung des Erregers ermöglicht werden. Das schafft die Voraussetzungen für die Bewertung des Gesundheitsstatus von Saatgutpartien. Gleichzeitig sollen auf diese Weise befallsfreie Fenchelpflanzen ausgelesen und unter sterilen Bedingungen als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von Saatgut vermehrt werden. Ergänzend wird die Option geprüft, durch intensive Fungizidbehandlung unter kontrollierten Bedingungen gesundes Ausgangsmaterial für die spätere Saatguterzeugung zu schaffen. Die Nachweismethoden liefern zusammen mit anderen Techniken darüber hinaus die Möglichkeit, den Pilz im Samengewebe zu lokalisieren und Ursachen der Blüteninfektion zu erforschen. Ein erster genombasierter Vergleich verschiedener Isolate von M. anethi ist vorgesehen. Die PCR-Methoden werden zunächst mit isolierter DNA aus Reinkulturen des Pilzes bzw. klonierten Genomfragmenten entwickelt. Versuche mit Pflanzen finden in vitro, im Gewächshaus sowie im Freiland statt. Der Befallsgrad von Pflanzen und Früchten wird sortenabhängig und in verschiedenen Umwelten ermittelt. Für Untersuchungen zur Pathogenese werden mikroskopische Techniken eingesetzt; der Isolatevergleich erfordert die Sequenzierung amplifizierter Genomfragmente. Übergabe einer praxisrelevanten Methode zum Nachweis latenter Infektionen (Pflanzen, Saatgut) mit M. anethi. Technologie zur Eliminierung des Pilzes und Erzeugung gesunder Samen. Erste Aussage zum Sortenverhalten und zur Pilzdiversitä
Ergebnisdarstellung
RT-PCR: Zur Isolierung der Pilz-DNA wurden 17 Kits verglichen, die DNA-Ausbeute war sehr gering. Daher wurde der Kit der Fa. Qiagen (Puregene Yeast/Bact. Kit B) in Kombination mit dem Reinigungskit der Fa. MP Biochemicals (Geneclean Spin Kit) verwendet. Das erprobte Primerpaar zum Erregernachweis war nicht spezifisch genug. Aus den Sequenzdaten weiterer DNA-Fragmente wurden 20 Primerpaare abgeleitet und getestet. Es wurden 2 Primerpaare selektiert, die die Sensitivität des Nachweises deutlich erhöhten. In einer RT-PCR war das Erregermycel in Keimlingen und Früchten klar nachzuweisen. DNA aus Gewebekulturpflanzen war eindeutig befallsfrei. Zum serologischen Nachweis wurde ein semi-quantitativer PTA-ELISA entwickelt, bei dem der Pilznachweis auch in symptomlosen Fruchtproben möglich war. Bei der Befallsbewertung von Proben aus Feldversuchen wurde eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen der Serodiagnose und der Sichtbonitur nachgewiesen. Der Befall des Erntegutes wurde nicht durch den Befallsgrad des Saatgutes bestimmt; der Standort und die Vegetationsbedingungen waren bedeutender. Eine Bewertung der Anfälligkeit von Sorten war mit dem Test sehr gut möglich. Zur Inkulturnahme von Fenchel in Gewebekultur wurden Pflanzen aus Erdanzucht mit einer starken Desinfektionsbehandlung (50 min in 0,1 % Sublimat) behandelt und das Kallusgewebe von 8 Sorten vermehrt. Bei 6 Sorten entwickelten sich Pflanzen, die in Erdkultur überführt wurden, um Saatgut zu gewinnen. Nach Untersuchungen in der RT-PCR war das Kallusgewebe von 10 Isolierungen erregerfrei. Im Folgeprojekt soll das Erntegut in der RT-PCR getestet werden. Die Anlage reiner Isolate von M. anethi ist experimentell anspruchsvoll und zeitaufwändig. Die Isolategewinnung gelang nur bei ca. 4 % der desinfizierten Blattstücke. Dennoch konnte eine Sammlung von 100 neuen Isolaten angelegt werden. Mit Hilfe von ITS-Primern wurden erste molekularbiologische Unterschiede zwischen diesen Isolaten nachgewiesen.

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Basisdaten Nachwachsende Rohstoffe
 
 
 
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